背景与需求

基因组编辑技术的突破性进展显著促进了新型细胞与基因疗法的开发。该技术不仅能实现现有基因的精准修饰，还可用于构建合成基因，在异基因治疗中构建免疫相容性细胞，为临床提供“现成”治疗方案。然而，基因编辑技术的安全有效应用仍有赖于新型工具的开发。其潜在风险主要来自两方面：一是在培养过程中获得的突变可能导致细胞恶性转化，以及在具有DNA修复缺陷的细胞中引发基因组不稳定性；二是编辑工具可能在基因组非目标位点引发DNA断裂，产生脱靶效应。脱靶编辑可能激活原癌基因或破坏抑癌基因，从而推动肿瘤发生。此外，脱靶诱变还可能产生新抗原，诱发自身免疫反应或其他细胞功能障碍。

因此，开发一种能在全基因组范围内高精度、无偏倚地检测编辑诱导的DNA双链断裂（DSB）的技术，对于评估基因编辑疗法的安全性、加速其临床转化具有核心意义。

技术方案：INDUCE-seq 的原理

INDUCE-seq是一种可扩展的DNA断裂定位与表征平台技术。它旨在解决上述安全性评估难题，其核心在于利用一种新型的无PCR原位断裂捕获方法。

技术核心与独特价值：

      无PCR偏差：INDUCE-seq 是首个无偏倚的、基于细胞的解决方案，根本上避免了因PCR扩增偏好性，确保了检测结果的客观性与真实性。

      广泛兼容性：INDUCE-seq具有广泛的细胞类型兼容性，与多种治疗相关的细胞类型兼容，并适用于任何基于核酸酶的基因编辑系统，普适性强。

      高精度检测：INDUCE-seq能够以高精度检测任何基于核酸酶的基因组编辑系统诱导的DNA断裂。

INDUCE-seq工作原理

如图1所示：在CRISPR-Cas9介导的基因编辑过程中，其核心步骤可分为两个连续的生物学阶段，并分别对应特定的高通量测序检测方法以实现对编辑事件的精准解析。第一阶段为基因编辑的“启动期”（Initiating Phase），即Cas9核酸酶在sgRNA引导下于预设基因组靶位点（通常邻近PAM序列）诱导产生双链断裂（Double-Strand Break, DSB），该过程伴随基因组不稳定性与DNA断裂事件的发生；

INDUCE-seq技术的核心创新即在于此阶段——它通过在细胞原位对DSB末端进行特异性标记（如连接化学修饰的P5测序接头），实现对断裂位点的高精度捕获与定位，且因建库过程无PCR扩增，每个测序读长严格对应单个DSB事件，从而获得无偏倚的1:1断裂信号表征。第二阶段为“编辑期”（Editing Phase），细胞启动内源性DNA修复机制，包括易出错的非同源末端连接（NHEJ）或精确的同源定向修复（HDR，需供体DNA模板），修复结果在靶位点引入插入、缺失、框移或点突变等遗传改变，最终实现基因敲入、敲除、条件性等位基因构建或报告基因整合等基因修饰目标；此阶段的遗传变化可通过Duplex-seq等高通量方法进行检测。因此，INDUCE-seq与Duplex-seq分别从“断裂发生”与“修复结果”两个维度，构建了从DNA损伤到基因编辑终产物的完整监测体系，为解析CRISPR编辑的动态机制与优化编辑效率提供了系统性的实验框架。

INDUCE-seq操作流程

如图2所示，在原位断裂标记实验中，首先对固定并透化的细胞进行DSB末端标记：通过将经化学修饰的全长P5测序接头连接至经末端预处理（如末端修复与平端化）的DSB末端，实现断裂位点的特异性标签化。随后，提取基因组DNA（gDNA），经物理或酶促片段化处理，并对片段末端再次进行标准化预处理，以确保接头连接的兼容性。接着，使用经化学修饰的半功能性P7测序接头进行二次连接，从而在DNA文库中形成两类片段：一类为功能性DSB标记片段（P5:P7结构，携带DSB标签），另一类为非功能性基因组背景片段（P7:P7结构，无DSB标签）。在测序前，通过流式细胞术（Flow Cell Enrichment）对文库进行富集，选择性捕获并保留P5:P7结构片段，从而高效去除非功能性P7:P7背景DNA。由于INDUCE-seq建库流程完全避免了PCR扩增步骤，每个测序读长（read）在统计学上严格对应单个细胞中一个被标记的DSB末端，确保断裂事件的定量表征无扩增偏差。与依赖PCR的非NGS方法相比，该方法实现了DSB信号的1:1无偏映射，避免了PCR引入的扩增偏好性与信号失真，从而提供更精确、可重复的基因组断裂图谱。

独立验证：HESI 交叉验证研究

一项在健康与环境科学研究所（HESI）的CT-TRACS委员会框架下开展的试点研究，旨在评估INDUCE-seq方法的可靠性。其设计是使用两种不同的细胞类型（GM24385和MCF10A），对五个经过充分研究的遗传靶点进行CRISPR-Cas9基因编辑，该技术可实现突变位点的高灵敏度检测。

流程一 测量基因组中的断裂，评估靶向和非靶向基因编辑

基于INDUCE-seq技术独特的数字读数特性，开发的脱靶位点筛选流程整合了断裂重复序列分析与引导RNA同源性分析，可生成潜在脱靶位点的超集，其分层报告系统支持将位点分为常见型、无偏型和序列依赖型三类并进行概率分析，HBD基因编辑位点的断裂分布可视化结果如图所示

流程二  高保真纠错测序技术定量位点的遗传变化

如图所示高置信度类别脱靶突变，表明断裂计数与突变积累之间存在显著比例关系。其中对照样本中的突变率反映了突变的背景水平。

INDUCE-seq性能验证

如表1所示，NDUCE-seq表现出优异的检测性能。

NDUCE-seq 可重复地、无偏倚地检测基因编辑诱导的DNA双链断裂

结果显示，在三次重复实验中，总断裂数和基于序列的脱靶位点数量均具有高度可重复性。不同细胞类型中DSBs的积累趋势存在差异，而CRISPR-Cas9活性峰值出现在转染后6小时。对五个靶点的分析进一步证实，靶向与非靶向DSBs的检测结果稳定且一致。

结论

INDUCE-seq 提供了一个数据驱动的、具有可操作性的见解平台，旨在加速基因编辑项目在研发、临床前和临床阶段的发展。通过其无偏倚、高精度且可重复的DNA断裂检测能力，它为解决基因编辑疗法的安全性评估难题提供了关键工具，有助于确保这些创新疗法的安全开发。

Broken String Biosciences是英国卡迪夫大学的衍生公司，致力于帮助基因编辑团队加快更安全、更有效的基因药物的开发。其成功开发出的一种高灵敏度、全基因组范围的DNA双链断裂检测新方法——INDUCE-seq®，不仅可精准识别基因编辑工具在预设靶位点诱导的双链断裂，还可系统性捕获其在基因组非靶向区域引发的脱靶断裂事件。目前，Broken String Biosciences已与全球多家基因编辑企业建立战略合作，为其提供早期、全面的编辑效应评估服务，从而助力提升产品安全性评价的科学性与可靠性，加速从临床前研究向临床应用的转化进程。本技术的核心使命在于增强基因编辑过程的可预测性与可控性，推动基因编辑技术向安全、有效、可监管的临床治疗方案稳健发展。

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