当我们已经验证过HCP ELISA与样品基质的兼容性，并且找到了样品的最低需求稀释度（MRD）后，那么下一步就是验证ELISA方法的精密度，进而完成法规要求的ELISA方法学验证的全部流程。

什么是精密度和重复性？

精密度是指多次检测结果之间的一致性程度，通常以实验的重复性进行评估，以变异系数（%CV）来表示。

计算公式：%CV=(标准差/平均浓度)×100%

通过此公式，可以评估两种精密度：

批内精密度：衡量单次实验内不同复孔之间的重复性。严格的批内CV表明样品读数不受加样位置或操作程序的影响。

批间精密度：衡量多次独立实验之间的重复性。确保批间CV在可接受范围内（通常＜15-20%，取决于法规要求）是证明该方法能持续稳定产出可靠结果的关键指标。

法规要求

      ICH Q2(R1)

方法：在3个浓度水平下至少进行9次测定，覆盖该测定的分析范围（在3个浓度下进行3次重复）

标准：未说明。

      US FDA

方法：至少在3个浓度水平下进行5次测定，覆盖该测定的分析范围（在3个浓度下进行5次重复）

标准：每个浓度水平下精密度的CV%应在±20%范围内，LLOQ的CV%不应超过25%。

      EMA

方法：在4种浓度下至少进行5次测定(在LLOQ、LLOQ的三倍以内、标准曲线浓度的30-50%、ULOQ的至少75%，4种浓度下进行5次重复）。

标准：每一浓度水平质控的批内和批间精密度均不应超过15%，LLOQ的CV%不应超过20%。

常见问题排查：导致CV值偏高的原因

如果实验结果的CV值高于试剂盒说明书中的预期范围，那么很可能是操作流程或设备出现了问题，我们建议您按以下步骤进行问题排查与实验优化。

1. 洗板操作

问题原因：

过度剧烈的洗板是CV值异常偏高的常见原因，包括使用自动洗板机、用力拍板等操作，因其可能导致抗原-抗体复合物发生非特异性解离，进而造成CV值过高。

优化建议：

为实现最佳重复性，我们强烈推荐洗瓶洗板法，可以通过交替方向加入洗液来确保每个孔的清洗时间保持基本一致。有关洗板的详细操作请参考下文。
如何用正确的洗板方法解决ELISA检测结果漂移的问题？

2. 酶标仪性能

问题原因：

当在低吸光度范围（如OD值＜0.1）的检测值出现较大波动时，可能提示酶标仪存在潜在问题。光源、单色器或滤光片的故障可能导致间歇性信号异常或噪声，此类问题通常无法通过常规校准程序识别，但会对检测的灵敏度以及定量限（LOQ）和检测限（LOD）产生显著影响。该类问题常表现为在空白孔或仅含有非吸附性液体的孔中，孔与孔之间OD值读数标准偏差达到0.020或更低。

优化建议：

对于HRP-TMB显色的ELISA，推荐使用双波长读数（如检测波长450nm，参比波长650nm）。通过双波长读数法，可从检测波长（如450nm）处的信号值中扣除非特异性信号（如650nm处的背景OD值），从而提高检测结果的准确性与可靠性。该方法可以最大限度地减少因污渍或塑料缺陷引起的孔间差异，从而提升精密度与准确度。

（注：质量良好的板条在参比波长（如650nm）的OD值通常很低（平均约0.040），且孔间OD值标准差极小（约0.002）。若实际检测OD值远高于0.040且标准差大于0.004，则表明酶标仪可能存在问题。）

3. 试剂污染

问题原因：

Cygnus的ELISA试剂盒灵敏度高达pg/mL至ng/mL级别，实验室环境中潜在的高浓度分析物（如培养基、上游工艺样品中的HCP或BSA，浓度可达mg/mL级），非常容易对试剂盒中的关键组分造成污染，如果检测结果出现孔板中个别孔吸光值偏差过大，且同一个试剂盒重复后偏差数据值相似，则可能是孔板的孔、标准品或酶标抗体出现了污染。

优化建议：

尽可能在远离处理上游样品的区域内进行ELISA实验操作，避免交叉使用移液器，做好操作台面与仪器的清洁，尽可能使用带有滤芯的吸头等。

4. 分析人员与仪器

问题原因：

操作不规范，移液器未校准或使用质量不达标的吸头，均可能对检测结果的精密度产生不利影响。

优化建议：

邀请另一位分析人员在独立实验室中使用不同设备进行平行测试，可能有助于您确定精密度不理想的原因是由于操作人员缺乏经验，还是常规实验室工具存在问题，比如移液器未校准或吸头质量差。

成功完成ELISA方法的精密度与重复性验证，是确保数据可靠、推动项目前进的基石。Cygnus针对每一种检测试剂盒均提供相应的QS（Qualification Summary）文件，如有需求欢迎点击这里填写信息索取，或直接联系Cygnus中国总代理西美杰。如您在使用Cygnus HCP ELISA试剂盒的过程中遇到任何问题，我们的技术支持团队将竭诚为您提供解决方案和建议。

Cygnus Technologies专注为生物技术和生物制药行业提供产品和分析方法超过25年，旨在加速研发阶段和提高产品质量。Cygnus开发和生产的生物工艺残留试剂盒，用于检测超过50种不同表达系统的特异性杂质。Cygnus作为专注于生物技术应用免疫检测的高灵敏度分析技术的专家，其产品和服务已经被全球超过95%以上生物制药公司使用，并获得FDA、NMPA、EMA等监管机构的广泛认可。

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