蛋白糖基化是一种非常重要的蛋白质后修饰方式。糖基化对蛋白质的理化性质和生物功能都可以产生重大影响，生物药分子的糖基化可能决定了其临床效果，因此糖基化在生物药生产中是一个关键质量属性，必须在开发和生产过程中密切监视，并在工艺中特异性分离或者去除糖基化分子。近些年来，硼酸亲和技术在糖蛋白纯化领域得到了快速的发展，其独特的亲和性引起了研究人员的极大关注。由于硼酸基于与顺式二醇基团可发生可控的可逆共价键合反应，后者在糖蛋白的糖链结构中广泛存在，因而硼酸亲和技术常被用做是一种选择性富集分离顺式二醇化合物的有效提纯手段。硼酸亲和作用的工作原理如下图。
APB亲和填料是由Astrea Bioseparations公司推出的配基为氨基苯基硼酸盐的亲和层析填料（Aminophenylboronate，简称APB），特别适用于糖蛋白的纯化，或从非糖基化分子中去除糖蛋白和碳水化合物杂质，从而应对糖蛋白纯化工艺中的各种挑战，此外，APB填料还可用于纯化和去除某些酶，例如硼酸基团对活性位点具有亲和性的蛋白酶和水解酶等。
APB亲和填料有两种不同的基架可选择，其中Aminophenylboronate P6XL采用的是Astrea专有的Purabead® P6XL近单分散琼脂糖微球来生产高度稳定的交联琼脂糖基架。 Purabead®产品具有非常均匀的粒径，可在低背压条件下实现可重现的层析柱装填和高流速。因此，Aminophenylboronate P6XL 是生物工艺应用的首选亲和填料。Aminophenylboronate A6XL是Astrea的原创产品，该填料的琼脂糖基质具有更宽的粒度分布，更适合小规模或诊断应用。两种基架都是经过优化的，有相同的稳定的配基和偶联物，都适用于各种生物制品的分离和纯化。
APB亲合填料产品特点
适用于亲和纯化或去除糖蛋白及聚糖
高纯度m-氨基苯硼酸盐配基
配基通过顺式二醇选择性结合至碳水化合物基团。
高动态结合载量
填料稳定性好，使用寿命长
可耐受0.5 M NaOH清洁，允许数百次循环使用
符合ISO 9001标准，批次稳定性重复性好
提供全面的法规支持文件（RSF），支持GMP生产和商业化申报
已有多个受监管的生物制药生产和医疗诊断领域用户使用。
pH稳定性:
APB亲和填料在pH 3-13（连续暴露）范围内稳定，并且可承受pH 14.0的间歇暴露。
在室温条件下，在从pH 0.0(1 M HCl) 到pH 14.0 (1M NaOH) 的一系列测试溶液中孵育的APB A6XL的pH稳定性曲线。收集上清液样品并以连续暴露1周至1年的特定时间间隔测定配基的脱落情况。
流速
APB P6XL的均匀粒径使该吸附填料能够在高线性流速下使用。可以使用高达500 cm/h的操作流速，尽管在层析柱上样和洗脱期间的流速通常在50–200 cm/h范围内。
APB P6XL（直径3.2 cm x床高15 cm）的压力-流速曲线。
结合载量
APB P6XL/A6XL对糖蛋白的结合载量范围为10–20 μmol/g，对碳水化合物的结合载量高达30 μmol/g。
操作条件
糖蛋白与APB亲和填料的结合在低至中等离子强度（10–300 mM）和弱碱性pH条件（pH 范围8.0–9.5）下最佳。可以使用磷酸盐制备的缓冲液，推荐使用硼酸盐和甘氨酸进行柱平衡。建议结合流速在50–150 cm/h之间。吸附填料的结合载量取决于样品的性质，对于糖蛋白来说，通常在10–20 μmol/g的范围内。
通过使用低pH缓冲液或通过使用竞争性二醇，可以从APB亲和填料中洗脱结合的蛋白质。可以使用pH4.0的0.1 M甘氨酸/HCl或0.1 M醋酸盐缓冲液降低pH值进行洗脱。对于酸不稳定性蛋白质，可以使用合适的竞争性二醇，例如20–200 mM山梨醇，在中性pH缓冲液中进行洗脱。
APB亲和填料参数
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步骤 |
条件 |
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平衡/装柱缓冲液 |
50 mM磷酸钠，pH 9.0缓冲液 |
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蛋白质制备 |
在平衡缓冲液中制备蛋白质，并用≤0.45 μm的滤器预过滤。 |
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操作流速 |
50-200 cm/h |
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洗脱 |
20–200 mM山梨醇或0.1 M甘氨酸/HCI或0.1M醋酸缓冲液，pH 4.0 |
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CIP |
0.5–1.0 M氢氧化钠 |
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预平衡 |
平衡缓冲液 |
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消毒 |
0.5 M NaOH |
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储存 |
20% 乙醇 |
应用案例
- 用APB P6XL纯化胎球蛋白
胎球蛋白是胎牛血清中的主要59 kDa糖蛋白，含有三个N-链和O-链碳水化合物侧链。该案例介绍了使用APB P6XL层析柱从商品化粗溶液中纯化胎球蛋白。
层析色谱图
胎球蛋白层析条件参数：
层析柱高度：4 cm
柱体积：3.1 mL
线性流速：50 cm/h
平衡&漂洗缓冲液：50 mM磷酸钠，pH 9.0
洗脱：山梨醇梯度(0–200mM)
消毒：1M NaOH
- 重组糖蛋白的捕获
APB层析填料特别适用于糖蛋白的捕获和纯化。下图展示了一个经典的亲和纯化色谱图，其中有一个大的流穿和一个小的离散洗脱峰。在50 mM山梨醇洗脱后达到完全的目标糖蛋白回收。
层析色谱图
层析条件参数：
层析柱：直径1.0 cmx柱床高7.4 cm
平衡漂洗/缓冲液：50 mM甘氨酸/NaOH pH 9.0
洗脱：50 mM 磷酸盐缓冲液，0-200 mM山梨醇梯度
消毒：0.5 M氢氧化钠
流速：200 cm/h
APB A6XL纯化的糖蛋白Western blot结果图（泳道1 分子量marker，泳道2 上样到APB A6XL的样品，泳道3 流穿液，泳道4-8 梯度洗脱液）
订购信息
Aminophenylboronate P6XL
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货号 |
填料规格 |
产品形式 |
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3355-00025 |
25 mL |
散装填料 |
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3355-00100 |
100 mL |
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3355-00500 |
500 mL |
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3355-01000 |
1 L |
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3355-05000 |
5 L |
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3355-10000 |
10 L |
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6716 |
1 x 1 mL |
预装柱 |
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6616 |
4 x 1 mL |
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6717 |
1 x 5 mL |
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6617 |
4 x 5 mL |
Aminophenylboronate A6XL
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货号 |
填料规格 |
产品形式 |
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0355-00025 |
25 mL |
散装填料 |
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0355-00100 |
100 mL |
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0355-00500 |
500 mL |
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0355-01000 |
1 L |
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