近年来，生物制药行业呈现出繁荣发展的趋势，很多大分子生物制品已经过监管部门批准上市，另有不少创新型大分子正处于临床后期或上市前申报阶段，即将为患者带来福音。例如，基于CHO细胞表达的单克隆抗体、基于大肠杆菌（E.coli）体系表达的重组蛋白或纳米抗体、基于HEK293细胞或昆虫细胞SF9表达的腺相关病毒（AAV）、基于酵母细胞表达的病毒样颗粒（VLP）等。不同于传统的小分子化学药，生物大分子的表达体系更为复杂，杂质种类更多（如宿主蛋白（HCP）和宿主DNA残留(HCD)等），杂质结构相对复杂，这给下游纯化带来了极大的挑战。

         基于传统微球技术的层析工艺是生物大分子纯化的重要手段，其具有工艺性能稳定、放大性良好等优点。近年来，多模式层析填料受到越来越多的关注。多模式层析填料往往具备至少两种相互作用机制，其中最常见的是将离子交换模式与疏水相互作用模式结合，可以在广泛的pH和电导率范围内有效纯化目标分子。

图1. HCPureTM配基结构和作用方式

HCPureTM是英国Astrea Bioseparations公司2023年推出的多模式层析填料，填料基架为粒径均一的高交联琼脂糖，基架上修饰有化学合成的小分子配基（图1），主要以疏水相互作用的方式结合料液中的杂质，同时兼具氢键相互作用模式（与市售主流产品作用原理不同，形成互补），适用于多种表达体系，在广泛的上样条件下，能稳健的去除料液中的HCP（宿主细胞蛋白）、HCD（宿主细胞DNA）、聚集体、分子片段等工艺或产品相关杂质。表1展示了HCPureTM在常见的表达体系中杂质去除能力。

表1. HCPureTM在多种表达体系中的应用效果

1. HCPureTM在大肠杆菌（E. coli ）表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中，研究人员使用大肠杆菌（E. coli ）表达纳米抗体Vκ，收获液先经过Protein L亲和层析纯化，洗脱液经中和后调节成不同的pH（6.0-8.0）和电导率（6-18mS/cm），随后以流穿模式上样HCPureTM，收集流穿液和淋洗液，检测Vκ和HCP的含量，以探究HCPureTM的最佳上样条件。测试条件如下表所示：

图2. E.coli表达体系中HCPureTM上样pH和电导率的探究

由图2的检测结果可知，在较低的pH（6.0）和较低的电导率（6ms/cm）上样条件下，HCP的去除效果最佳，同时目标分子Vκ的回收率最高。在最优上样条件下，料液中的HCP可以从30000ppm降至200ppm（2个log值的去除能力），Vκ回收率大于85%（表2）。

表2. HCPureTM在E. coli 表达体系中可以有效去除HCP

2. HCPureTM在CHO细胞表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中，研究人员使用CHO细胞表达IgG型单克隆抗体，澄清后的收获液先经过Protein A亲和层析纯化，洗脱液经中和后调节成不同的pH（4.0-9.0）和电导率（8-18ms/cm），再以流穿模式上样到HCPureTM中，收集流穿液和淋洗液，检测IgG和HCP含量，其中，pH 6.0、电导率12ms/cm是未经调节的亲和层析洗脱中和液。

表3. CHO细胞体系中，不同上样pH和电导率条件下，HCPureTM均可有效去除HCP

由表3的检测结果可知，在广泛的上样pH和电导率范围内，HCPureTM均可有效的去除上样料液中的HCP（平均84%），同时保持目标分子的高回收率（平均87%）。此外，由于pH 6.0、电导率12mS/cm是初始的亲和层析洗脱中和液，因此，亲和层析后，料液可不经过调整或缓冲液置换，直接上样到HCPureTM中，同样保持优秀的回收率和HCP去除效果，且大大节约了工艺时间和成本。

3. HCPureTM在CHO细胞表达体系中可以有效去除聚集体

在该应用案例中，研究人员使用CHO细胞表达IgG型单克隆抗体，料液经过Protein A亲和层析和阳离子交换层析纯化后，在较低的pH和较高的电导率条件下孵育，诱导产生高含量的聚集体，再以流穿模式上样HCPureTM，收集流穿液和淋洗液，检测聚集体含量。

表4. HCPureTM可显著去除抗体料液中的聚集体

由检测结果（表4）可看出，料液经过HCPureTM纯化后，聚集体由初始的6.7%降低到2.9%，HCPureTM可显著去除料液中的聚集体。

4. HCPureTM在HEK 293细胞表达体系中可以有效去除HCP

在该应用案例中，研究人员使用HEK293细胞以瞬转的方式表达2型腺相关病毒（AAV-2），病毒载体经过亲和层析纯化后，仍含有较高含量的低分子蛋白杂质，将亲和层析洗脱液置换到PBS+200mM NaCl（pH 7.5）中，以流穿模式上样到HCPureTM（10mm内径层析柱，柱高10cm），总上样量为5.0E+13VP，收集流穿液和淋洗液进行分析。

图3. SDS-PAGE检测结果

表5. ELISA检测结果

由SDS-PAGE结果（图3）可看出，流穿液中包含大部分病毒衣壳蛋白VP1，VP2和VP3条带（8-13泳道），而再生液（14泳道）中则包含大量的低分子蛋白杂质条带，表明HCPureTM可以有效去除料液中的蛋白杂质分子。由ELISA检测结果（表5）可知，流穿液中的病毒衣壳蛋白几乎全部回收（接近100%），表明HCPureTM在去除蛋白杂质的同时可以保持优秀的AAV回收率。

HCPureTM多模式层析填料技术参数

HCPureTM多模式层析填料产品信息

散装填料

预装柱

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Astrea Bioseparations于1987年孵化自剑桥大学，拥有超过30年层析介质研发和生产经验，是世界级层析介质产品与服务供应商。目前使用Astrea的产品已有超过21个生产工艺通过了FDA和EMA的批准。Astrea Bioseparations在全球拥有3个研发和生产基地，专注为生物大分子和CGT领域提供行业领先的层析介质和技术服务。Astrea Bioseparations推出的基于纳米纤维的新型层析技术，解决了传统生物分离工具载量低和工艺耗时问题，实现更快、更环保、更具成本效益的纯化过程，完全符合当今生物治疗创新的需求。

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参考文献：

1. J. Kreusser et al., Influence of pH value and salts on the adsorption of lysozyme in mixed-mode chromatography, 2021
2. R. Hess et al., Standardized method for mechanistic modeling of multimodal anion exchange chromatography in flow through operation, 2023
3. Technical Note: HCPURE™: A FIT FOR PURPOSE HOST CELL PROTEIN CLEARANCE SOLUTION IN E. COLI WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
4. Technical Note: HCPure™ host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
5. Technical Note: HCPure™ host cell protein clearance resin: Mixed mode chromatography as a means of process intensification, Astrea Bioseparations
6. Technical Note: HCPURE™: HOST CELL IMPURITY REMOVAL IN CHO WORKFLOWS, Astrea Bioseparations
7. Technical User Guide: HCPureTM, Astrea Bioseparations