如何应对植物组培过程中的污染问题?新型高效方法值得推荐

植物组织培养是20世纪初发展起来的一门新兴技术,随着这项技术的日益完善,其应用也越来越广泛。但是在组织培养过程中,常常会遇到污染问题使实验无法进行下去,甚至导致整个实验失败,给科研和工厂化生产带来损失。

污染是指在植物组织培养过程中,培养基和培养材料滋生杂菌,最终导致培养失败的现象。常见的污染类型包括由霉菌引起的真菌性污染、多由外植体带菌引起的细菌性污染长期多次继代引起的内生菌污染以及农杆菌污染等。面对植物组培污染问题,我们通常采取在培养基中加入适量的抗生素(如青霉素、链霉素、氯霉素等)来抑菌。但是抗生素一般不稳定,遇酸、碱或加热都易分解而失去活性。而且单一抗生素抑菌容易产生抗药性,一旦停止使用,污染率就会显著上升。同时,高浓度的抗生素会影响植物的生长。

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为解决问题,我们推荐专业植物组培高效广谱性抗菌剂PPM™,它可以有效预防和清除由于空气、灭菌不彻底、交叉污染、外植体消毒等各种原因导致的植物组培苗的真菌、细菌、内生菌和农杆菌污染。可以加入培养基高温灭菌而且在合理使用剂量下,不会对植物的生长产生任何影响。


使用方法如下:
1、常规污染预防用量:
一般推荐使用浓度为0.05%-0.2%(1L培养基中加入0.5-0.75ml PPM™)愈伤增殖, 器官形成,胚性组织发育等使用浓度0.05%-0.075%。
2、植物内生菌污染处理:
种子:PPM™不推荐用于直接处理含有大量的细菌或真菌孢子的种子灭菌对于种子离体萌发,建议先采用传统方法消毒,然后置于含 2-3%PPM™的全培养基础盐溶液中轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加Tween20和调pH处理完成以后直接插入含有 PPM™(草本植物0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培养基里进行培养。
外植体::以 1cm 外植体为例,将外植体置于含 4-5%PPM™的全培养基础盐溶液中,轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加 Tween20和调节pH,处理完成以后直接插入含有PPM™(草本植物 0.05-0.1%,木本植物0.2%)的培养基里进行培养。
块茎,球茎和鳞状物的观赏植物样本:将其整体放入消毒剂中搅拌消毒处理以后, 用水冲洗干净,将材料切成薄片,置于含 4-5%PPM™的全培养基础盐培养液中,轻轻搅拌4-12小时,此过程千万不能添加Tween20 和调节pH,处理完成以后无需冲洗直接插入含有 0.1-0.2%的PPM™的培养基里进行培养。
3、如果厚的外植体、污染严重的植株、种子等样本经过以上处理仍得不到理想效果,可尝试以下操作:
将材料浸泡在水中持续搅拌处理(松软组织搅拌1小时,硬实组织搅拌2小时)
将材料在含50%的PPM™全培养基础盐溶液中搅拌处理5-10分钟,此过程千万不能添加 Tween20 和调节pH
无需冲洗,将处理过的材料直接加入到培养基中即可。对于真菌污染,可在培养基中加入适当浓度的PPM™。对于真菌细菌混合性污染,建议在培养的第一个月的培养基中加入0.05%-0.2%的PPM™
4、严重污染材料污染去除与抢救(重污染不超过一周)
将污染的材料至于流水中用软刷刷洗,然后置于含50% PPM™的无菌水溶液中搅拌5-15分钟对于细菌或者混合性污染,建议使用 100% PPM™与 0.6g/L 的柠檬酸无菌水溶液按 1:1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液处理
处理后的材料无需清洗,直接插入含0.05%-0.25的PPM™的培养基中培养至少一个月以上,其中前10天需要弱光培养
5、农杆菌的去除
共培养以后,将样本用无菌水清洗,然后将样本浸没在 100% PPM™(补充4X的培养基盐溶液)中处理2分钟,取出后用无菌纸吸干后并置于常用抗性培养基中培养,3 周后,更换到只含有0.05%-0.075% PPM™(无常用抗生素)的培养基中培养。
注意事项:
在所有 PPM™消毒处理外植体的过程中,尽量保证容器的体积足够大,并使外植体材料所有面积与含PPM的处理溶液充分接触,以保证消毒效果;
如果外植体出现高度氧化现象,不要扔弃,大约50%的外植体在 4-6 周内即可恢复
50% PPM™ 的处理溶液可以重复使用但是不推荐,因为使用次数和效果受外植体的体积与接种密度的影响。将50% PPM™的处理溶液保存在4ºC可适当延长其活性,一般可使用不超过10次。如果必要,建议配制2份50% PPM™溶液,一份用于外植体消毒内生菌污染,另一份用于消除“培养过程中”的轻度污染材料抢救,第二份溶液在每次处理过后需要用 0.2mm滤器过滤
如果50%PPM™溶液处理效果不理想,可采用100%PPM™溶液进行处理,处理方法相同,但使用次数不得超过10次。




产品信息:

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产品已文献:

  1. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG.  Eradication of endophytic bacteria via treatment for axillary buds of Petunia hybrida using Plant Preservative Mixture (PPMTM). PCTOC. 2010;102(3):365-372.
  2. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG, Kuo JS. Bacterial endophyte in Macropidiafuliginosa: its localisation and eradication from in vitro cultured basal-stem callus. Aust J Bot. 2011;59(4):363-368.
  3. Lata H, Chandra S, Khan IA, ElSohly MA. Propagation through alginate encapsulation of axillary buds of Cannabis sativa L. — an important medicinal plant.  Phys and Mol Biol of Plants. 2009;15(1):79-86. 4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  5. Moghaddam S, et al. Optimization of an Efficient Semi-Solid Culture Protocol for Sterilization and Plant Regeneration of Centellaasiatica (L.) as a Medicinal Herb. Molecules. 2011;16(11): 8981-8991
  6. Çolgecen H, Koca U, Toker G. Influence of diff erent sterilization methods on callus initiation and production of pigmented callus in ArnebiadensifloraLedeb. Turk J Biol. 2011; 35:513-520
  7. Pouvreau J, et al. A high-throughput seed germination assay for root parasitic plants. Plant Methods 2013;9:32
  8. Marecik R, Bialas W, Cyplik P, Lawniczak L, Chrzanowski L. Phytoremediation Potential of Three Wetland Plant Species Toward Atrazine in Environmentally Relevant Concentrations. Pol. J. Environ. Stud. 2012;21(3):697-702
  9. Pérez Flores J, Aguilar Vega ME, Roca Tripepi R. Assays for the in vitro establishment of Swietenia macrophylla and Cedrelaodorata. Rev. Colomb. Biotecnol. 2012;14(1)
  10. Nesterenko-Malkovskaya A, Kirzhner F, Zimmels Y, Armon R. Eichhorniacrassipes capability to remove naphthalene from wastewater in the absence of bacteria. Chemosphere. 2012;87(10):1186-1191.
  11. Kieffer M, Fuller MP. In Vitro Propagation of Cauliflower Using Curd Microexplants. Meth Mol Biol. 2013;994:329-339.
  12. Kodym A, Temsch E, Bunn E, Delpratt J. Ploidy stability of somatic embryo-derived plants in two ecological keystone sedge species (Lepidospermalaterale and L. concavum, Cyperaceae). Aust J Bot. 2012;60(5):396-404.
  13. Peña-Ramírez YJ, et al. Induction of somatic embryogenesis and plant regeneration in the tropical timber tree Spanish red cedar [Cedrelaodorata L. (Meliaceae)]. PCTOC. 2011;105(2):203-209.
  14. Haddadi F, Adb Aziz M, Saleh G. Abd Rashid A, Kamaladini H. Micropropagation of Strawberry cv. Camarosa: Prolific Shoot Regeneration from In Vitro Shoot Tips Using Thidiazuron with N6-benzylamino-purine. HortScience. 2010;45(3):453-456.
  15. Jimenez VM, Castillo J, Tavares E, Guevara E, Montiel M. In vitro propagation of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot proliferation. PCTOC. 2006;86:389–395.
  16. Compton ME, Koch JM. Influence of Plant Preservative Mixture (PPM) on adventitous organogenesis in Melon, Petunia, and Tobacco. In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant. 2001;37:259-261

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